結(jié)果

純天然PIP2的相行為。通過(guò)將PIP2單分子膜從250?2/分子壓縮至50?2/分子，并觀察壓縮對(duì)界面表面壓力的影響，研究了純天然衍生PIP2的表面壓力（π）與分子面積之間的關(guān)系。10個(gè)單獨(dú)試驗(yàn)的平均等溫線如圖1a所示。正如純PIP2酰基鏈的已知組成所預(yù)期的那樣(～50%不飽和，33%花生四烯酸），隨著分子面積的減小，這些等溫線顯示出表面壓力平滑、單調(diào)的增加。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的任何條件下，均未觀察到PIP2單分子膜的相變。與生理?xiàng)l件相對(duì)應(yīng)的表面壓力下PIP2的平均面積(～30 mN/m 27）為73.1（3.0?2/分子，略大于SAPC（65?2）的公布值，28這是根據(jù)糖頭基的添加體積和靜電排斥預(yù)期的。盡管在生理pH下PIP2頭基的大小和相對(duì)較高的電荷密度，但該分子很容易形成緊密壓縮的單分子膜，而不是在較高的表面壓力下坍塌成水膠束結(jié)構(gòu)。在所有條件下，由于屏障泄漏或單層崩塌導(dǎo)致的脂質(zhì)損失導(dǎo)致的單層遲滯可以忽略不計(jì)，類似于SOPC等對(duì)照脂質(zhì)（數(shù)據(jù)未顯示）。

離子強(qiáng)度增加對(duì)PIP2單分子膜的擴(kuò)展效應(yīng)。為了研究離子強(qiáng)度對(duì)PIP2單分子膜行為的影響，在亞相不同濃度的NaCl下取了π-A等溫線。在高于5 mN/m的所有表面壓力下，添加NaCl可顯著擴(kuò)展單分子膜（圖1a）。在預(yù)先形成的PIP2單層的亞相中加入NaCl時(shí)也觀察到了這種反應(yīng)。在恒定分子面積下，添加250 mM NaCl后，表面壓力增加，其大小與等溫線實(shí)驗(yàn)中觀察到的大小相當(dāng)，在擴(kuò)散限制時(shí)間尺度上（圖1a插圖）。在π）30 mN/m時(shí)，每個(gè)PIP2分子的面積增加了13%，達(dá)到82.5?2/分子（圖1b）。該效應(yīng)的劑量反應(yīng)量化表明，該效應(yīng)在約200 mM NaCl下飽和，并在生理相關(guān)鹽濃度范圍內(nèi)顯示出顯著變化（圖1c）。

圖1：。NaCl對(duì)PIP2單分子膜的擴(kuò)張效應(yīng)。（A）π-含0 mM（9）和250 mM NaCl（2）的等溫線；（插圖）亞相注入250 mM NaCl（時(shí)間）0時(shí)，恒定面積/分子的表面壓力變化。（B）在pH 1.8（n）7）和pH 7.4（n）5）條件下，30 mN/m的每個(gè)分子的面積。（C）對(duì)亞相NaCl的劑量反應(yīng)。誤差條為平均值（n處為SE）5，除非另有說(shuō)明。所有數(shù)據(jù)均為HEPES緩沖亞相的L-R PIP2，pH 7.4（除非另有說(shuō)明），30°C。

為了測(cè)試靜電機(jī)制（如反離子云排斥）導(dǎo)致單層膨脹的可能性，使用與PIP2實(shí)驗(yàn)相同的條件，測(cè)量了250 mM NaCl對(duì)另一種帶電脂質(zhì)L-R PS的影響。PS的單分子膜與PIP2的單分子膜沒(méi)有受到相同的影響，相反，隨著亞相離子強(qiáng)度的增加，PS的單分子膜表現(xiàn)出非常輕微的收縮（圖2a）。

圖2：。鹽膨脹效應(yīng)對(duì)PIP2的特異性。（A）L-R PIP2和L-R PS的每分子面積；和（B）HEPES緩沖亞相上的L-R PIP2、L-R PI（4）P和L-R PI，pH 7.4，π）30mN/m下的30°C。平均值（SE，n）4。

為了確定PIP2特異性膨脹是否主要由大塊肌醇環(huán)引起，同時(shí)控制酰基鏈組成，用磷脂酰肌醇4-磷酸（LR PI（4）P）和磷脂酰肌醇（LR PI）重復(fù)壓力面積等溫線。由于這些分子是細(xì)胞中酶促PIP2生成的前體，它們的脂肪酸組成與PIP2相似或相同，只是在肌醇環(huán)上的磷酸取代程度不同。與PIP2一樣，兩種肌醇基脂質(zhì)均未觀察到相變，平均分子面積隨著磷酸取代度的增加而增加，與之前的觀察結(jié)果一致。29然而，盡管單磷酸鹽PI（4）P與二磷酸鹽PIP2表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，但PI和PI（4）P均未表現(xiàn)出對(duì)NaCl濃度增加的顯著擴(kuò)張，表明類似但小得多的影響（圖2b）。這些數(shù)據(jù)表明，NaCl誘導(dǎo)PIP2單分子膜擴(kuò)張的機(jī)制與其他陰離子以及其他肌醇基脂質(zhì)相比，是PIP2特有的。

與其他陰離子磷脂相比，除了NaCl對(duì)PIP2的擴(kuò)張效應(yīng)具有特異性外，該效應(yīng)還依賴于PIP2異構(gòu)體。對(duì)肌醇環(huán)（3和5、4和5、3和4）上不同位置被取代的合成PIP2類似物的分子面積進(jìn)行量化表明，分子面積不僅取決于磷酸鹽的位置，而且NaCl誘導(dǎo)膨脹的大小也受磷酸單酯在三種不同異構(gòu)體中的位置的影響（圖5a）。對(duì)這種膨脹的直接比較表明，對(duì)于PI（3,5）P2，0和250 mM NaCl之間的差異最大(～22?），然后是PI（4,5）P2（11?2）和PI（3,4）P2（5?2），并且PIP2異構(gòu)體之間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上非常顯著（p<0.001）。

圖5：。亞相氯化鈉膨脹效應(yīng)的PIP2異構(gòu)體特異性。（A）HEPES緩沖亞相上的DO-PIP2異構(gòu)體在π）30 mN/m時(shí)的每分子面積。平均值（SE，n）7。（B）250 mM NaCl和無(wú)亞相NaCl之間DOPIP2異構(gòu)體的每分子面積差異。通過(guò)雙向ANOVA測(cè)量，NaCl效應(yīng)的異構(gòu)體依賴性顯著達(dá)到p）0.0001。（C）PIP2分子間相互作用的概念動(dòng)畫(huà)。在沒(méi)有潮向性試劑（綠色橢圓）的情況下，PIP2分子形成水介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)添加潮向性聚合物時(shí)，網(wǎng)絡(luò)被破壞，帶電磷酸鹽之間的靜電排斥導(dǎo)致單層的膨脹。

不同反離子的影響。為了確定單價(jià)鹽對(duì)PIP2單分子膜的擴(kuò)張效應(yīng)的離子特異性，測(cè)試了其他陽(yáng)離子反離子的效應(yīng)。在250 mM時(shí)，所有測(cè)試的單價(jià)陽(yáng)離子（Na+、K+、Li+、Cs+）顯示出類似的、統(tǒng)計(jì)上顯著的PIP2單分子膜擴(kuò)展，其影響程度與離子的電荷密度直接相關(guān)，即Li+>Na+>K+≈Cs+（圖3a，p）0.15-0.3，因?yàn)閿?shù)據(jù)集有限，離子之間的差異）。這里觀察到的電荷密度依賴性不同于鹽誘導(dǎo)的低電荷陰離子磷脂單分子膜的膨脹，在鹽誘導(dǎo)下，沒(méi)有觀察到陽(yáng)離子依賴性或相反的趨勢(shì)。30與PG相比，不同陽(yáng)離子引起的PIP2膨脹的幅度30似乎與描述離子潮向性的Hofmeister級(jí)數(shù)直接相關(guān)（參考文獻(xiàn)31）。這一結(jié)果表明，除了對(duì)頭基質(zhì)子化產(chǎn)生影響外，這些離子還可能破壞單分子層內(nèi)多分子水介導(dǎo)氫鍵網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)。

圖3：。各種反離子的影響。（A）用250 mM鹽緩沖HEPES亞相上的L-R PIP2在π）30 mN/m處的每分子面積；平均值（SE，n）5。（B）π-L-R PIP2 HEPES緩沖亞相的面積等溫線，pH 7.4，30°C（實(shí)線），相同條件加250 mM CaCl2（虛線）；（插圖）250 mM CaCl2和MgCl2影響的量化；平均值（SE，n）4。

與單價(jià)鹽相比，二價(jià)反離子對(duì)PIP2的影響非常不同。CaCl2和MgCl2對(duì)純PIP2單分子膜都有很大的冷凝作用（圖3b）。圖3b中的代表性等溫線突出了這些差異，包括π）30 mN/m和較低表面壓力下每PIP2的面積。插圖顯示了二價(jià)陽(yáng)離子凝聚效應(yīng)的量化，并表明含有250 mM Ca2+和Mg2+的PIP2單分子膜分別比對(duì)照壓縮了15%和9%。這些結(jié)果與已知的Ca2+作為PIP2交聯(lián)劑的能力一致，Ca2+以高親和力結(jié)合和脫水多種磷酸鹽，32,33中和其電荷，橋聯(lián)頭基以形成緊密凝聚的單分子膜，34即使在低表面壓力下也是如此。

非離子液晶和溫度的膨脹效應(yīng)。為了驗(yàn)證單價(jià)鹽破壞PIP2頭基之間有吸引力的氫鍵相互作用的假設(shè)，部分克服了高頭基電荷密度預(yù)期的靜電排斥作用，測(cè)試了幾種非離子超嗜性因子破壞這些假定網(wǎng)絡(luò)和誘導(dǎo)單層膨脹的能力。尿素是一種因其潮向性而常用的蛋白質(zhì)變性劑，海藻糖是一種非還原性葡萄糖二聚體，因其破壞水結(jié)構(gòu)的能力而具有低溫保護(hù)特性，對(duì)其對(duì)PIP2單層的影響進(jìn)行了測(cè)試。與通過(guò)氫鍵的吸引相互作用相一致，兩種非離子超取向?qū)畏肿幽ざ加泻軓?qiáng)的膨脹效應(yīng)。在π）30 mN/m時(shí)，5 m尿素使每個(gè)PIP2分子的面積增加了近25%，達(dá)到90.9?2/分子，這是在這些實(shí)驗(yàn)中所采用的任何條件下觀察到的最高值（圖4b）。同樣，5 mM海藻糖顯著增加PIP2單層的面積9%。這些作用對(duì)PIP2有特異性，因?yàn)閮煞N處理對(duì)PI的單層都沒(méi)有顯著影響。

圖4：。水介導(dǎo)分子間氫鍵的證據(jù)。HEPES緩沖亞相上的L-R PIP2和L-R PI在π）30 mN/m時(shí)的每分子面積，pH 7.4（A）存在5 mM海藻糖和5 m尿素，（B）作為亞相（O）PIP2溫度的函數(shù)；0）PI）。

最后，為了驗(yàn)證氫鍵假設(shè)，對(duì)PIP2單分子膜的溫度依賴性行為進(jìn)行了測(cè)試。隨著亞相溫度從34°C降至17°C，這些單層顯示出非常顯著的收縮，每個(gè)分子的面積減少了近50%（圖4a）。相反，PI的單層僅收縮～在相同溫度范圍內(nèi)為10%，與kBT壓力的簡(jiǎn)單縮放一致。雖然由于脂質(zhì)動(dòng)能的降低，預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)一些收縮，但PIP2的50%差異強(qiáng)烈表明了另一種機(jī)制，如子相的熱能增加會(huì)破壞氫鍵網(wǎng)絡(luò)。純PIP2在亞相溫度以下不能形成壓縮單分子膜～15°C，相反，在相對(duì)較低的表面壓力下（小于10 mN/m；數(shù)據(jù)未顯示）出現(xiàn)坍塌。這一結(jié)果可能與理解溫度誘導(dǎo)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，例如血小板的冷激活，在此過(guò)程中，質(zhì)膜上PIP2組織的變化觸發(fā)肌動(dòng)蛋白組裝。35 PIP2在低溫下無(wú)法保持平面狀態(tài)也可能與在4°C下溶解的細(xì)胞膜耐去污劑部分中存在PIP2有關(guān)，14通常與脂筏有關(guān)。因此，從低于15°C的結(jié)果中無(wú)法推斷在較高溫度下富含膽固醇的結(jié)構(gòu)域中存在PIP2。

討論

多磷酸肌醇是一種重要的信號(hào)中間產(chǎn)物，但人們對(duì)產(chǎn)生或降解這些脂質(zhì)的酶的遺傳調(diào)節(jié)和表達(dá)的了解要比決定這些脂質(zhì)在質(zhì)膜內(nèi)分布或在不同細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的物理化學(xué)的了解多得多。由于它們帶有很大的負(fù)電荷，人們似乎普遍認(rèn)為，這些脂質(zhì)在雙層平面內(nèi)僅表現(xiàn)出相互排斥的相互作用，除非它們與特定的蛋白質(zhì)絡(luò)合，否則會(huì)使它們分散。20,23,36一些證據(jù)表明，PPI在產(chǎn)生洗滌劑不溶性脂質(zhì)組分的條件下被強(qiáng)烈隔離（通常被視為PPI定位于脂筏的證據(jù)14），而使用熒光能量轉(zhuǎn)移方法的研究提供了氫鍵可能穩(wěn)定富含PPI的簇合物的證據(jù)。24,25在這種情況下，目前的結(jié)果提供了PPI之間靜電相互作用大小的定量估計(jì)，并表明由氫鍵介導(dǎo)的吸引相互作用顯著抵消了靜電排斥。

用純靜電機(jī)制很好地解釋了PIP2的壓力-面積等溫線的一個(gè)特征是單價(jià)離子對(duì)表面壓力的一般影響。盡管單價(jià)鹽在PIP2單分子膜亞相中的膨脹效應(yīng)可能與頭基之間的靜電排斥作用不一致（亞相離子可能會(huì)屏蔽陰離子頭基，并允許更緊密的填充37,38），但亞相陽(yáng)離子導(dǎo)致的單分子膜膨脹是由于磷酸單酯電離電位對(duì)離子強(qiáng)度的依賴性，先前顯示磷脂酸單層。39這種效應(yīng)在調(diào)節(jié)荷電單分子膜的凝膠-液體轉(zhuǎn)變溫度方面很重要，40盡管亞相鹽與其他陰離子脂質(zhì)的膨脹效應(yīng)測(cè)量值遠(yuǎn)小于此處觀察到的PIP2膨脹效應(yīng)。30

最近，通過(guò)將系統(tǒng)建模為可電離基團(tuán)的均勻分布平面，確定了純靜電對(duì)PIP2單分子膜表面壓力的貢獻(xiàn)，其電荷密度是可電離基團(tuán)pKa和亞相溶液離子強(qiáng)度的函數(shù)。41通過(guò)區(qū)分熱力學(xué)勢(shì)與表面積的關(guān)系計(jì)算出的靜電排斥引起的表面壓力與一些觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果定性一致。在中性pH下觀察到的膨脹單分子膜（高達(dá)150?2/分子）的高壓可以用高電荷頭基的排斥作用來(lái)解釋。此外，中性pH下的靜電模型證實(shí)了具有低離子強(qiáng)度和高離子強(qiáng)度的等溫線之間的交叉以及由于高離子強(qiáng)度導(dǎo)致的單層膨脹（參考文獻(xiàn)41中的圖1a和圖4b）。然而，許多實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)果與純靜電處理不兼容。具體而言，不同單價(jià)離子的不同影響不能完全通過(guò)亞相離子強(qiáng)度的變化來(lái)解釋。NaCl誘導(dǎo)的單層擴(kuò)張的PIP2異構(gòu)體特異性以及不帶電的潮向性和溫度的影響也表明了比表觀頭基pKa的嚴(yán)格靜電亞相離子強(qiáng)度調(diào)制更復(fù)雜的分子機(jī)制。此外，pH值為1.8時(shí)亞相鹽的膨脹效應(yīng)（圖1b）與預(yù)測(cè)在所有磷酸單酯質(zhì)子化的條件下沒(méi)有靜電效應(yīng)的模型不一致（參考文獻(xiàn)41中的圖4f）。最后，在幾乎所有情況下，實(shí)驗(yàn)測(cè)定的PIP2表面壓力明顯低于純靜電效應(yīng)保守估計(jì)的預(yù)測(cè)值。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果突出了吸引力相互作用的重要性，這種相互作用可能是由氫鍵介導(dǎo)的，可以顯著對(duì)抗平面系統(tǒng)中PIP2脂質(zhì)之間的排斥靜電相互作用。這些有吸引力的相互作用可能會(huì)被一些朝潮性因素破壞，如單價(jià)離子、海藻糖或尿素。這些發(fā)現(xiàn)總結(jié)在圖5c所示的定性模型中。在沒(méi)有干擾劑的情況下，幾個(gè)PIP2分子通過(guò)水介導(dǎo)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)相互作用。當(dāng)存在破壞水-PIP2相互作用的離子因素或非離子超取向物時(shí)，氫鍵被破壞，靜電排斥導(dǎo)致分子面積增加。該模型得到了單價(jià)陽(yáng)離子對(duì)純PIP2單分子膜擴(kuò)展效應(yīng)的大小以及尿素和海藻糖（強(qiáng)非離子向潮性）的影響的支持。建議的氫鍵狀態(tài)和超臨界膨脹狀態(tài)之間的計(jì)算能量差（對(duì)于250 mM LiCl：?面積）17.8?2/分子（35 mN/m時(shí)）～6 kJ/mol）與每個(gè)PIP2分子約一個(gè)氫鍵的損失相當(dāng)。這種能量與PIP2和MARCKS之間的多價(jià)相互作用能具有相同的尺度(～16千焦/摩爾）。23混合脂質(zhì)系統(tǒng)中PIP2頭基之間存在分子間氫鍵的可能性已在實(shí)驗(yàn)24,25和模擬42中得到證實(shí)，本文提供的數(shù)據(jù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這種可能性，實(shí)驗(yàn)表明氫鍵是PIP2分子間相互作用的一個(gè)重要因素。

溫度對(duì)PIP2單分子膜的影響也表明這些脂質(zhì)之間存在重要的非靜電相互作用。隨著溫度的降低，表面壓力的顯著下降遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他帶電液相脂質(zhì)的下降，并且不簡(jiǎn)單地與熱能成比例。事實(shí)上，純PIP2單分子膜在室溫下的穩(wěn)定性明顯低于37°C，并且不能在15°C以下形成。PIP2單分子膜在低溫下的崩塌可能與假設(shè)的PPI在低溫下聚集有關(guān)，被認(rèn)為會(huì)觸發(fā)血小板的冷激活和可能的其他生物功能。35

對(duì)于觀察到的亞相鹽效應(yīng)，靜電學(xué)和氫鍵的另一種解釋是，單價(jià)鹽嵌入陰離子頭基平面，在磷酸鹽和陽(yáng)離子之間形成網(wǎng)絡(luò)晶格。這一解釋似乎不太可能，因?yàn)榕蛎涀畲蟮氖亲钚　⒆钫姷碾x子（Li+），而隨著離子半徑的增大而減小（圖3a）。此外，盡管在沒(méi)有鹽的情況下形成波紋相可以產(chǎn)生更壓縮的單層，但沒(méi)有通過(guò)任何等溫線觀察到從液相到波紋相的相變（圖1a）。此外，波紋相僅可能在高表面壓力下形成，而在低至5 mN/m的壓力下，高鹽和低鹽狀態(tài)之間的差異很明顯（圖1a）。

有兩條證據(jù)表明水在維持這種網(wǎng)絡(luò)中的重要性，而不是相鄰PIP2分子之間的直接氫鍵。預(yù)計(jì)不會(huì)與磷酸基團(tuán)相互作用的非離子溶質(zhì)尿素和海藻糖對(duì)PIP2單分子膜具有強(qiáng)烈的擴(kuò)張效應(yīng)，這可能是由于它們破壞了水結(jié)構(gòu)并隨后干擾了氫鍵網(wǎng)絡(luò)（圖4a）。其次，二價(jià)陽(yáng)離子（Ca2+和Mg2+）誘導(dǎo)的PIP2每個(gè)分子面積的顯著減少證實(shí)了它們能夠橋接相鄰脂質(zhì)，從而導(dǎo)致界面脫水，并表明盡管PIP2單分子膜通過(guò)氫鍵能力保持壓縮狀態(tài)，它們不像被二價(jià)陽(yáng)離子直接交聯(lián)時(shí)那樣被緊密壓縮（圖3b）。

許多實(shí)驗(yàn)表明，PIP2的許多細(xì)胞結(jié)合伙伴至少有兩種不同的相互作用模式。一些蛋白質(zhì)（例如，含有PH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)）對(duì)單個(gè)PIP2分子有一個(gè)特定的結(jié)合位點(diǎn)，43–45，而其他蛋白質(zhì)則含有非結(jié)構(gòu)化的多元酸結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為可以通過(guò)非特異性靜電吸引同時(shí)結(jié)合多個(gè)PIP2分子（例如，MARCKS23,46）。考慮到細(xì)胞可能通過(guò)影響氫鍵和靜電排斥之間的平衡來(lái)調(diào)節(jié)PIP2介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)可用于單個(gè)脂質(zhì)結(jié)合蛋白域的PIP2池與可用于結(jié)合多分子組裝的PIP2池，這似乎是合理的。

確認(rèn)。這項(xiàng)工作得到了MRSEC第05-20020號(hào)贈(zèng)款（I.L.和P.A.J.）和富布賴特基金會(huì)（A.C.）的資助。